Сравнение микрокалориметрического и спектрофотометрического методов определения стабильности белков

Введение

ДСК и спектроскопия в УФ/видимом диапазоне представляют собой эффективные методы для описания температурной стабильности структурных доменов белков и нуклеиновых кислот. Хотя спектроскопия и дает представление о температурной стабильности доменов, только ДСК позволяет напрямую измерить энтальпию процесса разворачивания молекул. Следовательно, ДСК позволяет провести более полный анализ термодинамических свойств полипептида, чем спектроскопия в УФ/видимом диапазоне.

Экспериментальные методы:

Метод иллюстрируется на примере плавления плазмидной ДНК pBR322 (Volker et al., Biopolymers, 50, 303-318, 1999). ДНК нагревали со скоростью 0.1°C/мин для спектроскопических измерений и 1°C/мин – для измерений ДСК. Данные были подвергнуты деконволюции, чтобы можно было сравнить результаты спектроскопии и калориметрии.
Рисунок 1.
пример плавления плазмидной ДНК pBR322

 Краткое изложение:

На Панели А Рисунка 1 представлены данные спектроскопии в УФ/видимом диапазоне, а на Панели В представлены данные, полученные с помощью Nano DSC. В обоих наборах данных деконволютированные пики отражают совокупное плавление структурных доменов плазмиды. Важно отметить, что на Панели А представлено усреднение по 12 независимым оптическим сканированиям, а на панели В представлено усреднение по двум независимым ДСК-сканированиям. Таким образом, благодаря десятикратно большей скорости сканирования и меньшему количеству сканирований, ДСК позволяет получить данные исключительного качества за гораздо меньшее время, чем спектроскопия УФ/видимого диапазона.
Величина, форма и распределение видимых глазом пиков в обоих наборах данных являются сходными, однако ДСК выявляет некоторые особенности, не очевидные на спектроскопических данных. Volker et al. впоследствии использовали ДСК для определения термодинамического вклада конкретных сегментов плазмидной ДНК, внося в последовательность вставки и удаления, что позволяет охарактеризовать эффекты аллостерических молекул и соседних доменов на термодинамические свойства последовательности.

Характеристики Nano DSC: