Christin T. Choma, PhD. TA Instruments, 890 West 410 North, г. Линдон, штат Юта, 84042, США
Самосборка вирусных белков и нуклеиновых кислот с образованием стабильных частиц и механизмы, с помощью которых вирусы связываются с клетками-хозяевами и проникают в них, представляют собой две важные проблемы, связанные с пониманием основ вирусной инфекции. Обе эти проблемы могут быть изучены с помощью калориметрии. Термическую стабильность белков оболочки вируса в растворе, в сравнении со стабильностью соответствующей высокоорганизованной белковой оболочки вируса, наиболее эффективно можно охарактеризовать при помощи дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК), тогда как фундаментальную информацию о молекулярных взаимодействиях, являющихся движущими силами процессов связывания вируса и клетки, можно получить путем измерения выделившейся или поглощенной теплоты при помощи изотермической титрационной калориметрии (ИТК). В настоящей публикации изучается применение ДСК и ИТК для исследования стабильности вирусных частиц и их связывания с клетками, а также для идентификации вирусов. Хотя литературы, в которой рассматриваются термодинамические свойства скоплений вирусных частиц и их стабильность, пока немного, эта ситуация будет меняться, учитывая рост интереса к использованию калориметрии для идентификации вирусов, а также для определения структуры и болезнетворности вирусов.
Норовирус является основной причиной гастроэнтерита. Вирус состоит из РНК-генома, заключенного в оболочку, состоящую, главным образом, из основного капсидного белка, и он попадает в организм с загрязненной едой или водой. Основной капсидный белок имеет два структурно различающихся домена, и подвергается самосборке в условиях in vitro, образуя пустые, неинфекционные вирус-подобные частицы, структурно и иммунологически сходные с интактным вирусом. В ходе своего инфекционного цикла вирус сталкивается с большими колебаниями pH. Выполненное методом ДСК изучение неинфекционных вирус-подобных частиц (Ausar et al., 2006) в диапазоне pH от 3 до 8 выявило два четко разделенных эндотермических пика при pH 3: больший пик, с центром при 66 oC, и меньший пик с центром при 92 oC. При менее кислых значениях pH высокотемпературный переход смещается в сторону более низких температур, а при нейтральном значении pH он накладывается на более низкотемпературный переход. Протеолитические исследования показали, что низкотемпературный переход был обусловлен устойчивым к протеолизу С-концевым доменом, а высокотемпературный переход обусловлен меньшим расщепляемым N-концевым доменом. Эти результаты согласуются с тем, что вирус должен оставаться интактным в кислотных условиях после попадания в пищеварительный тракт, и расщепляться и высвобождать РНК после проникновения через мембрану клетки желудка в цитоплазму (с нейтральной pH). Исследования методом ДСК оболочек парвовируса, состоящих только из капсидного белка, также показали различные конформации и стабильность в зависимости от условий среды, сходных с теми, с которыми вирус сталкивается в своем жизненном цикле (Carreira et al., 2004). В этом случае конформационные изменения протекали в два этапа. ДСК-сканирование показало, что нагрев оболочек до 46 oC приводил к частичной экстернализации N-конца белка, с последующей диссоциацией оболочки на белковые мономеры при 75 oC.
Стабилизирующее влияние вирусной нуклеиновой кислоты на вирусные частицы изучали с использованием интактных вирусов табачной мозаики и мозаики турнепса, а также пустых оболочек, состоящих из одного капсидного белка. Данные ДСК и другие биофизические исследования интактного вируса турнепса показали, что нагрев разрушает вирус в три стадии: сначала происходит высвобождение РНК и конформационное изменение в оболочке, затем диссоциирует пустая оболочка и, наконец, денатурируется капсидный белок (Mutombo et al., 1993). В случае вируса табачной мозаики интактный вирус стабилизируется, приблизительно, на 15oC относительно оболочки из капсидного белка, а это указывает, что РНК вступает в специфические стабилизирующие взаимодействия с белковой оболочкой (Orlov et al., 1998). Температурная стабильность отдельного капсидного белка в растворе или в небольших агрегатах, приблизительно, на 30 oC ниже, чем если белок встроен в сложноорганизованную оболочку из капсидного белка. Авторы указывают на известный факт, что присутствие свернутого белка оболочки в растворе ингибирует разборку вируса. Это должно помогать инфекции, поскольку нестабильность мономеров или небольших агрегатов капсидного белка помогает довести до конца процесс разборки, запущенный высвобождением и разворачиванием некоторого числа молекул капсидного белка в инфицированной клетке.
Метод ДСК также был использован для исследования температурной стабильности аденовируса, излюбленного переносчика, применяемого для доставки трансгенного материала в соматические клетки, с целью определения влияния факторов среды, таких как pH и сахара, на стабильность вируса (Rexroad et al., 2002; Ihnat et al., 2005). Ihnat et al. (2005) изучали очищенный основной капсидный белок дикого типа (гексоновый белок), вирус дикого типа (Ad/WT) и мутантную форму вируса (rAd/p53) в различных буферных растворах. У мутантного вируса наблюдалось три эндотермических перехода, а у дикого типа – четыре перехода. У капсидного белка наблюдались две эндотермы (Рис. А), но отсутствовала эндотерма 50 oC, характерная для интактного вируса. Деконволюция пика около 50 oC (Рис. В) для вирусных частиц показывает, что эта эндотерма состоит из двух термических событий, зависящих от концентрации. На основании этих и других калориметрических данных, авторы делают вывод, что переход на 50 oC представляет собой разрыв вирусной частицы на белок и нуклеиновую кислоту, и что переходы около 70 и 75 oC связаны с конформационными изменениями гексонового белка. Переход на 50 oC необратим, и поскольку его положение, форма и размер зависят от концентрации и условий среды, авторы предполагают, что положение этого перехода может использоваться для различения мутантов аденовируса, а также для скрининга и оптимизации стабилизирующих препаратов.
Рис. А: Результаты ДСК-сканирования отдельного капсидного белка (гексон), мутантного вируса (rAd/p53) в двух концентрациях и в разных буферах, и вируса дикого типа (Ad/WT). Образцы сканировались при скорости 1 oC/мин на приборе Nano-DSC. Рис В: Результаты деконволюции пика ~ 50 oC. (Ihnat et al., 2005).
Сборка сложных вирусов, таких как бактериофаги и некоторые вирусы эукариот, часто требует присутствия шаперонов и протеаз. Температурную стабильность вирусов давно изучают методами ДСК, и изменения температурной стабильности в процессе созревания соотносят со структурными изменениями, наблюдаемыми при помощи рассеяния рентгеновских лучей и электронной микроскопии. Вероятно, наиболее детальные температурные профили были получены для бактериофагов T4 (Ross et al., 1985; Steven et al., 1992), P22 (Galisteo and King, 1993; Galisteo et al., 1995) и HK97 (Ross et al., 2005; Ross et al., 2006). В случае HK97, белок-предшественник капсидного белка, gp5, подвергается самосборке в пентамеры и гексамеры, которые, в свою очередь, собираются в прокапсиды. Далее следует N-концевой протеолиз, расширение капсидной частицы, конформационные перестройки, ковалентная поперечная сшивка, и далее вставка ДНК (Ross et al., 2006). Процесс созревания приводит к образованию все более стабильных частиц, и некоторые этапы (протеолиз и поперечная сшивка) предотвращают обращение процесса вспять. Интактный вирус не подвергается термической разборке без использования 5М мочевины.
Вирусы проникают в клетки, используя один из двух общих механизмов или их сочетание: Прямое слияние с клеточной мембраной (оболочечные вирусы) и через эндоцитозные или иные везикулы (безоболочечные вирусы). Последний механизм обусловлен рецепторами на поверхности клеток, хотя некоторые вирусы могут сливаться с мембраной клетки-хозяина и при отсутствии рецептора. Для изучения обоих типов инфицирования используют калориметрию.
Оболочечные вирусы животных клеток проникают в клетку-хозяина, сливаясь с клеточной мембраной, что инициируется конформационными изменениями гликопротеинов оболочки вируса. Конформационное изменение может быть запущено кислой средой в эндосоме или взаимодействием с определенным рецептором на поверхности клетки. Вирус гриппа сливается с мембраной клетки в кислой среде. Вирусная оболочка состоит из липидной мембраны и трех трансмембранных белков, один из которых, гемагглютинин, подвергается в кислой среде крупным конформационным изменениям. В результате этого открывается гидрофобный сегмент, который способствует слиянию вируса с мембраной клетки-хозяина. ДСК-сканирование гемагглютинина при нейтральном pH дает одну объединенную эндотерму с большой энтальпией, с Tm = 66 oC, а при pH 5 белок разворачивается менее кооперативно, при 45 oC, с трехкратно меньшим изменением энтальпии (Remeta et al., 2002). ДСК и спектроскопические исследования интактного вируса гриппа, проведенные с целью определения реакции встроенного в вирусную мембрану белка-гемагглютинина на pH и температуру, также показали существенные отличия между кислой и нейтральной pH. Как и в случае с очищенным белком, гемагглютинин интактного вируса разворачивался кооперативно при 66 oC при нейтральном pH, но при pH 5 значение Tm снижалось до 60 oC, энтальпия, по существу, не менялась, хотя кооперативность значительно снижалась. Авторы сделали вывод, что снижение стабильности гемагглютинина при кислом pH инициирует слияние мембран вируса и клетки, обусловленное открытием гидрофобного сегмента, однако гемагглютинин в интактом вирусе при сходных условиях является менее нестабильным, чем очищенный белок. Эксперименты с ИТК-анализом интактного и инактивированного вируса гриппа при нейтральном и кислом pH позволили разделить события связывания и слияния мембран, и показали, что слияние мембран является эндотермической реакцией, проходящей исключительно при кислом pH (Nebel et al., 1995).
ИТК и другие исследования вируса везикулярного стоматита показали, что вирусный белок слияния связывается и экзотермически сливается с везикулами из фосфатидилхолина/фосфатидилсерина (1:3) при pH 6.0, тогда как при pH 7.5 происходит связывание, но не слияние (Carneiro et al., 2002, 2006). Тот факт, что связывание является экзотермическим, предполагает, что оно может быть обусловлено электростатическими взаимодействиями. Связывание не происходило, если везикулы не содержали фосфатидилсерина, или если остатки гистидина в пептидах, соответствующих предполагаемой зоне связывания вирусного белка слияния, были замещены на остатки аланина. Данные ИТК свидетельствуют, что при связывании вирусного белка слияния с клеткой гистидиновые остатки в связывающей области белка подходят близко к отрицательно заряженным концевым группам фосфатидилсерина, в результате чего происходит протонирование гистидина и взаимодействие белка слияния с клеточной мембраной.
ВИЧ является, вероятно, наиболее широко изучаемым оболочечным вирусом. Инфицирование запускается, когда белок оболочки вируса gp120 взаимодействует с рецепторами CD4 на клетке-мишени, что запускает конформационные изменения вирусной оболочки и ведет к ее слиянию с клеткой-мишенью. Изучение с помощью ИТК взаимодействия между gp120 и CD4 (Myszka et al., 2000) показало очень благоприятную энтальпию связывания (приблиз. -63 ккал/моль (-264 кДж/моль)), Однако энтропия связывания велика и неблагоприятна, что указывает на значительную утрату конформационной свободы при связывании, и в результате прочность связывания является средней (2 x 108 M-1). Кроме этого, реакция связывания протекает медленно. Независимые исследования белка CD4 продемонстрировали, что его структура при связывании остается, по существу, неизменной, и это указывает, что неблагоприятная энтропия связана, главным образом, с перестройкой gp120. Медленное связывание согласуется со значительными конформационными изменениями, происходящими при образовании комплекса.
Широкие исследования безоболочечного вируса, именуемого вирус обезьяны 40, показали, каким образом вирус распознает и связывает свой рецептор на клетке-хозяине без образования прочной связи, которая помешала бы размножившимся вирусам мигрировать к новым клеткам-хозяевам. Данные ИТК показали, что вирус распознает свой гликопротеиновый рецептор с миллимолярной аффинностью, но эксперименты с гликановым скринингом показали, что при презентации вирусу массива гликанов, вирус, предпочтительно, связывается с разветвленным олигосахаридом, находящимся на рецепторе. Кристаллографические данные показывают, что специфичность связывания достигается благодаря двум ветвям олигосахарида, одновременно взаимодействующим со связующим углублением (Neu et al., 2008).
В 1997 г. Shnyrov et al. показали, что ДСК-сканирование образца вирусов псевдочумы птиц с постепенным повышением температуры (последовательный отжиг) дает четыре эндотермических бистабильных перехода, соответствующих четырем основным белкам вируса. Результаты свидетельствуют, что ДСК-профиль вируса можно использовать в качестве метода идентификации. Данная концепция была расширена, и стала включать не только идентификацию видов вирусов, но и идентификацию отдельных штаммов. Например, Krell et al. (2005) с помощью ДСК охарактеризовали различные штаммы вирусов полиомиелита и гриппа. Каждый штамм имеет характерную картину из нескольких переходов разворачивания, которые отличаются по Tm, форме и энтальпии, и близкородственные штаммы имеют существенные отличия в этой картине (например, близкородственные штаммы A/PR8/34 и New Caledonia вируса гриппа H1N1, или штаммы X-31 и Panama вируса H3N2). Авторы предполагают, что на ДСК-профиль вируса сильно влияют белки оболочки. Поскольку именно эти белки часто отличаются у близкородственных штаммов, метод ДСК может стать широко применяемым простым и быстрым подходом к идентификации инфекционных штаммов вирусов.
Объем исследований, включающих изучение структуры и способов функционирования вирусов с помощью ИТК и ДСК, быстро растет. Метод ДСК неоценим для изучения термодинамического профиля структуры вируса, что позволяет выяснять стабильность компонентов вируса и достоверно описывать и идентифицировать вирусные штаммы. Вирулентность вируса зависит от его способности специфически связываться с мишенью и инфицировать клетки. Показано, что метод ИТК является надежной технологией анализа, которую можно использовать для эффективного описания любых межмолекулярных событий связывания, происходящих между вирусом и его рецепторами. Поскольку вирусы состоят всего из нескольких основных белковых компонентов и нуклеиновых кислот, вероятно, неудивительно, что детали того, как эти компоненты упакованы и взаимодействуют друг с другом, могут быть изучены калориметрическим методом на интактных вирусах. В то же время, уровень специфической структурной информации, получаемой при четко спланированном эксперименте с использованием ДСК и ИТК на интактных вирусах, может соперничать с другими методами, требующими использовать для получения интерпретируемых данных очищенные белки и нуклеиновые кислоты. Быстрая, точная оценка структуры вируса и факторов вирулентности может быть очень важна для расширения базы данных о соотношении структуры и активности вирусов, что позволит вовремя реагировать на вирусные вспышки и пандемии.
References:
Ausar, S., T. Foubert, M. Hudson, T. Vedvick and C. R. Middaugh (2006). Conformational stability and disassembly of Norwalk virus-like particles. J. Mol. Biol. 281, 19478-19488.
Carneiro, F, M. L. Bianconi, G. Weissmuller, F. Stauffer and A. Da Poian (2002). Membrane recognition by vesicular stomatitis virus involves enthalpy-driven protein-lipid interactions. J. Virol. 76, 3756-3764.
Carneiro, F. et al. (2006). Probing the interaction between vesicular stomatitis virus and phosphatidylserine. Eur. Biophys. J. 35, 145-154.
Epand, R. M. and R. F. Epand (2002). Thermal denaturation of influenza virus and its relationship to membrane fusion. Biochem. J. 365, 841-848.
Carreira, A., M. Menendsz, J. Reguera, J. M. Almendral and M. Mateu (2004). In vitro disassemably of a parvovirus capsid and effect on capsid stability of heterologous peptide insertions in surface loops. J. Mol. Biol. 219, 6511-6525.
Galisteo, M. L. and J. King (1993). Conformational transformations in the protein lattice of bacteriophage P22 procapsids. Biophys. J. 65, 227-235.
Galisteo, M. L., C. L Gordon and J. King (1995) Stability of wild-type and temperature-sensitive protein subunits of the phage P22 capsid. J. Biol. Chem. 270, 16595-16601.
Ihnat, P. et al. (2006). Comparative thermal stabilities of recombinant adenoviruses and hexon protein. Biochim. Biophys. Acta 1726, 138-151.
Krell, T., et al, (2005) Characterization of different strains of poliovirus and influenza virus by differential scanning calorimetry. Biotechnol. Appl. Biochem. 41, 241-256.
Mutombo, K., B. Michels, H. Ott, R. Cerf and J. Witz (1993). The thermal stability and decapsidation of tymoviruses: a differential scanning calorimetric study. Biochimie 75, 667-674.
Myszka, D. G et al. (2000). Energetics of the HIV gpl20-CD4 binding reaction. PNAS91, 9026-9031.
Nebel, S., I. Bartoldus and T. Stegmann (1995). Calorimetric detection of influenza virus induced membrane fusion. Biochemistry 34, 5705-5711.
Neu, U., K. Woeliner, G Gauglitz and T. Stehle (2008). Structural basis of GM1 ganglioside recognition by simian virus 40. PNAS 105, 5219-5224.
Orlov, V. N., S. V. Kust, P. V. Kalmykov, V. P. Krivosheev, E. N. Dobrov and V. A. Drachev (1998). A comparative differential scanning calorimetric study of tobacco mosaic virus and of its coat protein ts mutant. FEBS Letters 433, 307-311.
Remeta, D. P., M. Krumbiegel, C. Minetti, A. Puri, A. Ginsburg and R. Blumenthal (2002). Acid-induced changes in thermal stability and fusion activity of influenza hemagglutinin. Biochemistry 41, 2044-2054.
Rexroad, J., C. Wiethoff, A. Green, T. Kierstead, M. Scott and C. R. Middaugh (2002). Structural stability of adenovirus type 5.J. Pharma. Sci., 92, 665-678.
Ross, P. D., L. W. Black, M. E. Bisher and A. C. Steven (1985). Assembly-dependent conformational changes in a viral capsid protein. Calorimetric comparison of successive conformational states of the gp23 surface lattice of bacteriophage T4. J. Mol. Biol. 183, 353-364.
Ross, P., N. Cheng, J. Conway, B. Firek, R. Hendrix, R. Duda and A. Steven (2005). Crosslinking renders bacteriophage HK97 capsid maturation irreversible and effects an essential stabilization. EMBO J., 24, 1352-1363.
Ross, P., J. Conway, N. Cheng, L. Dierkes, B. Firek, R. Hendrix, A. Steven and R. Duda (2006). A free energy cascade with locks drives assembly and maturation of bacteriophage HK97 capsid. J. Mol. Biol. 364,512-525.
Steven, A. C, H. L. Greenstone, F. P. Booy, L. Black and P. D. Ross (1992). Conformational changes of a viral capsid protein. Thermodynamic rationale for proteolytic regulation of bacteriophage T4 capsid expansion, co-operativity, and super-stabilization by Soc binding. J. Mol. Biol. 228, 870-884.
Shnyrov, V. L., G. G. Zhadan, C. Cobaleda, A. Sagrera, I. Munoz-barroso and E. Villar (1997). A differential scanning calorimetric study of Newcastle disease virus: identification of proteins involved in thermal transitions. Archives Biochem. Biophysics 341, 89-97.